Actualmente existe en México un 4% de casos de epilepsia (SERSAME-Secretaría de Salud), de los cuales el 80% corresponden a epilepsia de Lóbulo Temporal. Hasta el momento la administración de los fármacos antiepilépticos es por vía sistémica (oral, intramuscular, etc.); con esta forma de administración se pierde alrededor del 90% del compuesto activo y sólo llega menos del 10% al foco epiléptico en el cerebro; además de causar efectos secundarios tóxicos severos en el paciente. La alternativa desarrollada en este proyecto de investigación científica, fue obtener un dispositivo nanoparticulado biocompatible con tejido cerebral que liberara directamente el fármaco en el sitio afectado. Para este propósito se controló en el nanomaterial: la porosidad, tamaño de partícula, fase cristalina, grupos funcionales de la superficie nanoestructurada, concentración de fármaco ocluido, densidad electrónica, biocompativilidad, etc. De esta manera se obtuvo una liberación controlada del fármaco antiepiléptico “in situ” en SNC, directamente en las neuronas del lóbulo temporal. Esta liberación del antiepiléptico se logró a largo plazo (un año). Así mismo, el proyecto abarca la colocación del reservorio del material nanoestructurado, usando cirugía estereotáxica en ratas Wistar, estudios histopatológicos e inmuno-histoquímicos para comprobar la biocompatibilidad del material implantado y el estudio funcional de eficiencia de liberación en animales a quienes se les indujo epilepsia por el método de Kindling (químico y eléctrico) valorando su efecto sobre la actividad eléctrica espontánea e inducida de neuronas de rata. ¿Por qué Nanociencia y Nanotecnología?
Hemos desarrollado una habilidad para transformar la materia, pero no para crearla. A pesar de esto a cada momento nos sorprendemos de la cantidad de nuevos materiales que surgen día con día, por ejemplo en el área de la química inorgánica y su aplicación en las ciencias de la vida o los nuevos biomateriales. Nuestro entorno tecnológico está lleno de sólidos con propiedades físicas y químicas que hace apenas una década jamás nos hubiéramos imaginado. Pero éstas no se han descubierto como el caucho, sino que a través de la comprensión de cómo se unen los átomos y las moléculas, es decir, trabajando con lo pequeño “nano”. Una legítima aspiración de alguien que trabaje en el área de materiales es ser capaz de predecir en forma confiable el comportamiento de éstos en una amplia escala de tamaños y tiempos. Además, también hacer arquitectura de los átomos y moléculas que componen el material; es decir, propiedades a escala atómica.
Hemos desarrollado una habilidad para transformar la materia, pero no para crearla. A pesar de esto a cada momento nos sorprendemos de la cantidad de nuevos materiales que surgen día con día, por ejemplo en el área de la química inorgánica y su aplicación en las ciencias de la vida o los nuevos biomateriales. Nuestro entorno tecnológico está lleno de sólidos con propiedades físicas y químicas que hace apenas una década jamás nos hubiéramos imaginado. Pero éstas no se han descubierto como el caucho, sino que a través de la comprensión de cómo se unen los átomos y las moléculas, es decir, trabajando con lo pequeño “nano”. Una legítima aspiración de alguien que trabaje en el área de materiales es ser capaz de predecir en forma confiable el comportamiento de éstos en una amplia escala de tamaños y tiempos. Además, también hacer arquitectura de los átomos y moléculas que componen el material; es decir, propiedades a escala atómica.
El término clínico conocido como epilepsia se define como una despolarización de las neuronas, caracterizada por la repetición de crisis, consecuencia de una descarga eléctrica excesiva. Dicha manifestación consiste en una serie de acontecimientos anormales, bruscos y transitorios, que pueden incluir alteraciones de la conciencia, motoras, sensoriales, autonómicas o psíquicas percibidas por el paciente o un observador. Según una clasificación de tipo, existen crisis generalizadas, parciales o focales, de múltiples tipos y no clasificables. Actualmente los tratamientos farmacológicos recomendados son poco accesibles al grueso de la población debido a sus altos costos. Un aspecto importante en la medicación es la periodicidad de las tomas de los fármacos lo cual implica una gran regularidad y control de dosificación. Si se considera que la mayor parte de los tratamientos son sintomáticos, es decir que su interrupción suele provocar la reaparición de las crisis, su administración se prolonga durante años, en ocasiones toda la vida, y esto exige una valoración especial de aspectos tales como la toxicidad, comodidad de administración y cumplimiento terapéutico, que depende en gran medida del nivel socioeconómico de los pacientes.
La epilepsia mesial temporal se genera por la pérdida neuronal y la existencia de astrogliosis, generando una disminución del tamaño del hipocampo. La atrofia hipocampal se identifica en la imagen RM mediante la comparación de ambos lóbulos; disminuye el tamaño del hipocampo y existe alteración de la señal, logrando así un porcentaje de detección del 80 al 90%. Los especialistas en estudios de epilepsia en ratas tipo Wistar detectan exactamente la posición del foco epiléptico. Es exactamente en “el foco” donde se coloca el nanoreservorio biocompatible para la liberación del fármaco antiepiléptico. Se ha diseñado una cánula para hacer un cilindro de 1 mm por 1.5 mm de tamaño y 1.5 g de peso.
Cirugía estereotáxica para colocar el reservorio en varios grupos de ratas Wistar. La colocación de los reservorios en el lóbulo temporal de las rata se realizó con cirugía estereotáxica. Para ello se usó un Atlas estereotáxico, el cual es un conjunto de mapas cerebrales de las ratas. Estos mapas tienen coordenadas que permiten al especialista que la va a efectuar, llegar a una determinada región del cerebro de la rata con un aparato estereotáxico. La referencia externa de localización se llama Bregma. En cada mapa del atlas se presenta una estructura del cerebro que ubica los ejes espaciales necesarios. Un atlas estereotáxico contiene todas las secciones cerebrales, tales como: secciones frontales tomadas a diferentes distancias anteriores y posteriores a bregma. Así, localizando en
una de las páginas de un atlas estereotáxico una estructura neural (que no se puede ver a en nuestro animal), se puede saber la localización exacta de la misma en relación a bregma. Siempre es necesario probar una serie de coordenadas, cortar y teñir el cerebro del animal, ver dónde se ha realizado la lesión, corregir los valores y hacerlo con una “n= número de animales” que nos de una estadística casi exacta. La “n” en este proyecto siempre será n=6.El Aparato estereotáxico, es un instrumento que permite al experto situar el reservorio por medio de una cán
ula en un lugar específico del cerebro. El dispositivo incluye un soporte para la cabeza, que mantiene el cráneo del animal en la orientación adecuada, un soporte para la cánula y un mecanismo calibrado que permite desplazar este soporte en los tres ejes espaciales a lo largo de las distancias previamente calculadas: anterior-posterior, dorsal-ventral, y lateral-medial. Tras haber obtenido las coordenadas estereotáxicas, el investigador anestesia al animal, lo coloca en el aparato, y corta el cuero cabelludo. Así, deja expuesto el cráneo de forma que se puede situar la punta de la cánula o del electrodo sobre el bregma. El experto mide la localización de este punto para cada uno de los ejes y mueve la cánula a lo largo de la distancia adecuada en los ejes antero-posterior y lateral-medial hasta situarlo en un punto exactamente por encima del objetivo. Trepana entonces un agujero a través del cráneo justo por debajo de la cánula y hace descender el dispositivo a través del tejido nervioso hasta la profundidad necesaria. Ahora la punta de la cánula se halla situada en el lóbulo temporal para este proyecto y el investigador produce la lesión. La cirugía estereotáxica se utilizó también en el presente trabajo para colocar los electrodos del electroencefalógrafo (EEG) y dar seguimiento al estudio de epilepsia (provocada por Kindling químico) con y sin reservorio cargado de los antiepilépticos. En ambos casos, una vez finalizada la intervención quirúrgica se cose la herida, se saca al animal del aparato estereotáxico y se le permite recuperarse de la anestesia.
Para la implantación de titania en la amígdala basolateral (ABL) los animales se anestesiaron con ketamina-xilazina (80 y 12 mg/kg. i.p. respectivamente), mediante cirugía estereotáxica se colocó un cilindro de titania de 1 X 1.2 mm de diámetro y altura respectivamente en la ABL (coordenadas AP = -2.3; L = 4.8; V = 8.5, Atlas de Paxinos y Watson, 1998). Se dejaron en recuperación durante 7 días con alimento y agua ad libitum en cajas de acrílico individuales.
Micrografías de Barrido de cortes histológicos del lóbulo temporal de varias series de ratas Wistar, motivo del presente estudio: (a) sección de amigdala con el reservorio de TiO2-fenitoina sódica después de 6 meses de implantado. Se observa en la frontera tejido-nanoreservorio de TiO2-fenitoina sódica que no hay dispersión de nanopartículas. (b) sección de amigdala con el reservorio TiO2-fenitoina sódica completo, después de 12 meses de implantado. Se midió con el microscopio y permanece intacto en tamaño y sin haberse movido del lugar que se colocó. (c) acercamiento a 3000 X hacia el reservorio TiO2-fenitoina sódica, el tamaño de nanopartícula se mantiene después de un año de colocado en el tejido cerebral. (d y f) sección de amigdala con el reservorio de TiO2-ácido valproico después de 6 meses de implantado, se puede observar que no se ha movido y no hay dispersión de las nanopartículas. En la frontera tejido cerebral – reservorio no hay dispersión de las partículas. (e) acercamiento a 3300X en donde se ve claramente que el tejido cerebral entra en el reservorio. (g) grupo de neuronas. (h) corte de amígdala de rata sana después de seis meses de implantada. (i) acercamiento a 4500 X del tejido alrededor del implante. (j). acercamiento al implante de TiO2-fenitoina sódica después de 1 año de implantado que muestra que a pesar de que el tejido cerebral entra en los poros de la matriz nanoestructurada, este no tapa los poros del material y permite la liberación del fármaco sin problema. (k) acercamiento a 4000X en los alrededores del implante TiO2-ácido valproico después de 8 meses. (l) grupo de neuronas alrededor del implante TiO2-ácido valproico el aumento es 2000X. (m) acercamiento de la micrografía anterior para captar una sola neurona con un aumento de 5500X. (n) vasos sanguíneos en el corte histológico anterior. (o) rata Wistar. (p) portamuestras de microscopía electrónica de barrido con un corte histológico de la amigdala. 
Estudio histopatológico
Los cerebros fueron cortados y conservados en solución de formaldehído al 4% durante 15 días. Se obtuvieron secciones de 10 μm en parafina y se observaron en un microscopio óptico Leica. El corte está teñido mediante la técnica de Bielchowsky, la cual permite visualizar microfibrillas neuronales e integridad del soma celular. Se observó claramente que la posición del implante no varía después de seis meses de permanencia en el encéfalo de los animales de experimentación, lo cual indica una alta compatibilidad entre la reservorio nanoestructurado y el tejido nervioso.
Para comprobar la no existencia de respuesta glial ante el implante, se obtuvieron cortes de la zona encefálica implicada para realizar un análisis histológico y evaluar el daño neuronal. En la figura se observa el implante de TiO2-solgel y la interacción con el tejido nervioso sin detectarse lisis celular, aunque alrededor del TiO2 se aprecia una reacción que sugiere ligera inflamación.
Cinética de liberación
Las siguientes cinéticas de liberación han sido obtenidas “in vitro”. Se hicieron pastillas de 20 gramos de las muestras de TiO2–sol-gel-xVPA y TiO2–sol-gel-xPh con diferentes concentraciones de fármaco. Estas se colocaron en un vaso de precipitados en 80 mL de agua destilada a una temperatura de 37.3 °C. Toda experiencia se hizo por triplicado. Se tomaron alícuotas del sobrenadante para ser analizadas y cuantificada la cantidad de fármaco, usando espectroscopía UV-Vis (Varian Cary III Spectrophotometer). Se usó un pico característico de la fenitoina sódica a 232 nm. En los reservorios de ácido valproico la cuantificación se hizo con espectroscopía infrarroja y las pastillas fueron inmersas en agua deuterada.
Los cerebros fueron cortados y conservados en solución de formaldehído al 4% durante 15 días. Se obtuvieron secciones de 10 μm en parafina y se observaron en un microscopio óptico Leica. El corte está teñido mediante la técnica de Bielchowsky, la cual permite visualizar microfibrillas neuronales e integridad del soma celular. Se observó claramente que la posición del implante no varía después de seis meses de permanencia en el encéfalo de los animales de experimentación, lo cual indica una alta compatibilidad entre la reservorio nanoestructurado y el tejido nervioso.
Para comprobar la no existencia de respuesta glial ante el implante, se obtuvieron cortes de la zona encefálica implicada para realizar un análisis histológico y evaluar el daño neuronal. En la figura se observa el implante de TiO2-solgel y la interacción con el tejido nervioso sin detectarse lisis celular, aunque alrededor del TiO2 se aprecia una reacción que sugiere ligera inflamación.
Cinética de liberaciónLas siguientes cinéticas de liberación han sido obtenidas “in vitro”. Se hicieron pastillas de 20 gramos de las muestras de TiO2–sol-gel-xVPA y TiO2–sol-gel-xPh con diferentes concentraciones de fármaco. Estas se colocaron en un vaso de precipitados en 80 mL de agua destilada a una temperatura de 37.3 °C. Toda experiencia se hizo por triplicado. Se tomaron alícuotas del sobrenadante para ser analizadas y cuantificada la cantidad de fármaco, usando espectroscopía UV-Vis (Varian Cary III Spectrophotometer). Se usó un pico característico de la fenitoina sódica a 232 nm. En los reservorios de ácido valproico la cuantificación se hizo con espectroscopía infrarroja y las pastillas fueron inmersas en agua deuterada.
La velocidad a la cual tanto el ácido valproico (VPA) como la fenitoina sódica (Ph) son liberados está determinado por la porosidad del material en el cual están encapsulados, así como por las fuerzas débiles de interacción que existen entre la matriz → reservorio. Se observa en ambos casos que existe un decremento en la concentración liberada. Esto se puede explicar si hacemos un balance de masa. El resultado de este estudio muestra una descarga importante en las primeras horas (al que llamamos disparo inicial). Posteriormente la velocidad de liberación es muy lenta, tal y como esperábamos.
Resultados de la liberación controlada de los fármacos antiepilépticos (ácido valproico) en las diferentes series de ratas cepa Wistar (n=6).
El ácido valproico es un medicamento de amplio espectro ya que protege contra las crisis generalizadas, mioclonías, crisis parciales complejas, etc. Su mecanismo de acción es aumentar los niveles de GABA y hasta la fecha se desconoce cuales son los sitios blanco sobre los que actúa en el SNC. Es aplicado por vía sistémica y protege contra las crisis de ECH, PTZ (Ragsdale y Avoli (1998). En este caso en particular (tecnología de punta) se libera de un material nanoestructurado colocado directamente en el foco epiléptico.
La epilepsia en las ratas de este proyecto es provocada con Pentilentetrazol (PTZ) ya que es utilizado ampliamente por su conveniencia y parecido al Kindling eléctrico de la amígdala. Después de tener a las ratas presentan crisis epilépticas en fase IV y V, se dejan recuperar las ratas durante 7 días y posteriormente se implanta el reservorio y se inicia la valoración de los efectos de la aplicación de reservorio de TiO2-solgel-VPA en la amígdala basolateral (ABL), sobre las crisis provocadas por el Kindling químico.
El ácido valproico es un medicamento de amplio espectro ya que protege contra las crisis generalizadas, mioclonías, crisis parciales complejas, etc. Su mecanismo de acción es aumentar los niveles de GABA y hasta la fecha se desconoce cuales son los sitios blanco sobre los que actúa en el SNC. Es aplicado por vía sistémica y protege contra las crisis de ECH, PTZ (Ragsdale y Avoli (1998). En este caso en particular (tecnología de punta) se libera de un material nanoestructurado colocado directamente en el foco epiléptico.
La epilepsia en las ratas de este proyecto es provocada con Pentilentetrazol (PTZ) ya que es utilizado ampliamente por su conveniencia y parecido al Kindling eléctrico de la amígdala. Después de tener a las ratas presentan crisis epilépticas en fase IV y V, se dejan recuperar las ratas durante 7 días y posteriormente se implanta el reservorio y se inicia la valoración de los efectos de la aplicación de reservorio de TiO2-solgel-VPA en la amígdala basolateral (ABL), sobre las crisis provocadas por el Kindling químico.
El implante del reservorio TiO2-solgel nanoestructurado, sin antiepiléptico no provocó ninguna alteración conductual ni electrográfica sobre las crisis por kindling. El implante del reservorio con fenitoina sódica solo protegió a la mitad de los animales kinleados. Sin embargo, el implante de los reservorios TiO2-solgel-VPA-100, 200, 400 no provocó ninguna alteración conductual en las ratas, indicativo de que no existe daño neurotóxico y las protegió de crisis generalizadas en un 96% cuando se implantó la matriz TiO2-solgel-VPA-200. Este reservorio implantado en la ABL inhibió la difusión de la actividad epiléptica desde la ABL en ratas previamente kindleadas debido a la liberación local del ácido valproico directamente en la ABL.
